阳性对照样本

使用 HiFi 长读长测序从全血中对总共 35 个样本（来自 26 个家庭的 30 名受试者至 5 名对照；表 1 和补充表 1）进行测序。根据可用的库 DNA，基因组覆盖范围从 25.2 到 38.8 倍，其中四个异常样本为 8.5 到 18.1 倍，因为 DNA 已被初始临床测试耗尽。

五个先前诊断的样本用作对照（表 1）：（C1）患有伊曼纽尔综合征的儿童（衍生多生染色体 22 和 11 融合；MIM：609029）15； (C2) 9 号和 18 号染色体之间明显易位； (C3) 一种破坏 EYA 的诊断倒置 [MIM:602588]； (C4) IKBKG [MIM:300636]16 (VCV000429392) 中的两个碱基缺失； (C5) 15 号染色体的单亲异二体导致 Prader-Willi 综合征 [MIM:176270]。 LRS 对所有五个对照都是决定性的。对于病例 C1、C3 和 C4，因果变异被 LRS 正确识别（补充图 1）。对于病例 C5，甲基化分析显示 15 号染色体上已知母体印记基因座的双等位基因高甲基化，包括 MAGEL2、NDN 和 SNRPN 的外显子。 （图。1）。对于案例 C2，LRS 表明明显的易位是在 SCAI 的内含子中插入经过处理的假基因 SMAD4（补充图 1）。

Prader-Willi 综合征 (PWS) 中 chr15 的双等位基因高甲基化。 HiFi 读数的甲基化分析显示，在患有 Prader-Willi 综合征的男性患者 C5 中，已知 chr15 印记基因座的两种单倍型都发生了高甲基化。不相关的、未受影响的男性对照 F12 显示一个等位基因的低甲基化。 HiFi 读取按序列分阶段分为单倍型 1s 和 2。值显示了在每个基因组 CpG 位点甲基化的每个单倍型的读取百分比。 h1 单倍型 1，h2 单倍型 2。

接下来，评估了 LRS 在 32 个样本的基因组中复制 SRS 识别的小变体的能力。总体而言，LRS 稳健地再现了 SRS 结果，正确识别了 99.6% 的 SNV 和 96.9% 的小插入或缺失（补充表 2）。在剩余的 SNV 中，仅 LRS 检测到 0.8%，而仅 SRS 检测到的 SNV 为 0.4%。其余的小插入/缺失几乎在两者之间平均分配，每种测序方式都有约 2% 的变体是独特的。

病例

我们选择了 30 例 SRS 诊断为阴性的病例。所有病例之前都通过我们的标准临床管道进行了分析17。简而言之，使用了 DRAGEN 比对和小变异调用，然后通过读取深度和基于读取对的方法（简约议会）的共识进行 CNV 和 SV 变异调用，以及内部开发的人口频率过滤和优先级工作流程17。随后，我们的 plan-Beta 管道也分析了 SRS 数据，该管道使用 Tiddit18、Delly19 和 GridSS20 询问基因组的结构变异，并使用 GangSTR 和 Expansion Hunter、microCNV（内部开发）、移动插入元素（内部开发），使用 Splice AI 和 scap 的神秘剪接突变，以及 5ʹ UTR 起始增益（内部开发）11,18,19,20,21,22。这些病例中的大多数（n = 22）是由临床遗传学、神经病学、重症监护和代谢学部门的儿科专家提名确定的，他们认为尽管 SRS 基因组结果为阴性，但患者的诊断可能是遗传起源的。这些患者中的大多数患有综合征并受到严重影响。在 22 名临床医生提名的病例中，另有 4 名患者的家庭成员受到影响。此外，我们选择了 4 名具有特定表型（免疫缺陷）的患者，共 30 例（补充表 1）。

确定最有可能受益于 LRS 的表型

除了 22 例提名病例外，我们还试图确定某些表型是否可能特别受益于 LRS，特别是相关基因可能隐藏在 NGS 死区中的疾病。为此，我们使用 300 个优质亲本全基因组测序 (WGS) 样本（平均覆盖率 40 倍）确定了短读长“死区”，这些样本已根据拉迪儿童基因组医学研究所 (RCIGM) 进行了短读长测序经验证的临床方案。样本在性别之间平均分配（150 名女性，150 名男性）并且来自未受影响的父母。死区与 Mandelker 等人发表的结果一致。谁在 Illumina HiSeq 2500 平台上使用了 WES，并且必须为 Illumina NovaSeq 6000 平台上的 WGS 进行了更新9。两种技术之间的这种调整是必要的，因为 NovaSeq 技术使用一种替代的、更快速的 2 通道通过合成变异进行测序，这种变异可能具有不同的死区边界。然后我们确定了这些死区中每个基因的编码碱基总数。之后，我们将基因与其相应的人类表型本体 (HPO) 疾病表型相关联，如果适用，因为一些基因尚未与人类疾病建立关系。随后，我们汇总了每个表型的所有基因的死区碱基，这使我们能够按相关死区的总大小对表型进行排序（图 2）。在此分析之后，由于基因的大小，一些基因 TTN、SMN1/2 和 NEB 往往在 HPO 排名中占主导地位，并从进一步的分析中删除。排名最高的 HPO 术语是“常染色体隐性遗传”，其次是与男性不育、听力障碍和免疫介导表型相关的几个 HPO 术语（补充表 3）。我们的儿科队列缺乏与前两种表型相关的样本，因此我们选择专注于免疫介导的表型，因此从我们的生物储存库中选择了四个未确诊的 SRS 病例，免疫缺陷作为其呈现表型来接受 LRS。

确定 LRS 最可分析的 HPO 术语的说明性示意图。 (A) 为每个基因（蓝线）计算数百个基因组的平均 SRS 基因组覆盖率（灰色条）。 (B) 疾病基因映射到 HPO 术语。 (C) 组装术语和 (D) 组装每个 HPO 术语的基因数量和 SRS 不可覆盖的大小。然后这些可用于优先考虑患者进行长读长测序。

LRS 揭示了 SRS 死区

通过长读长进行的全基因组测序成功覆盖了所有 NGS 死区总长度的 98%，从而可以在这些区域中明确地调用变体。剩余的 2% 不可调用区域位于 180kb 的一个连续范围内（chr16:33,148,000–33,328,000）。 LRS 在全基因组范围内平均鉴定出 54,900 个（1.3%）额外的小变异，其中 440 个（1.8%）位于编码附近区域，其中 73% 位于 SRS 死区或低可映射性区域 23 其余的要么短读取难以映射的大插入或删除。尽管覆盖了 98% 的基因组和 LRS 的方法学优势，但我们无法在 22 名临床医生提名的病例及其四个受影响的家庭成员中找到任何分子诊断。然而，在接受 LRS 的四种免疫缺陷表型病例中，在一名先证者中发现了 IKBKG（核因子 kappa-b 激酶抑制剂，调节亚基 gamma）中的母系遗传的停止损失变体（p.X420Yext27；VCV00011450）。该变体先前已在 ClinVar 中报告为可能致病 (LP)。该变异在母亲中是杂合子，在男性先证者中是半合子，他们在 1 周龄时被送入新生儿重症监护室 (NICU)。他入院时的体格检查发现肝脾肿大。实验室评估表明异常的免疫球蛋白和异常骨矿化显着成像。对潜在遗传疾病，特别是原发性免疫缺陷的临床怀疑很高，但 SRS 的超快速 WGS 未能识别任何致病性或可能的致病性变异。患者在婴儿期死于严重感染。验尸 LRS 在 IKBKG 中发现了上述止损变异，该基因由于具有大于 99% 的同源性的假基因而隐藏在 NGS 死区中。 c.1260 G >在这种情况下发现的 C 取代导致第 420 位终止密码子的丢失并将该密码子变为酪氨酸，从而在新阅读框的第 27 位产生新的终止密码子（参见补充图 2）。 IKBKG（核因子 kappa-b 激酶抑制剂，调节亚基 gamma），以前称为 NEMO（NF-kappa-b 必需调节剂），对于激活 NF-κB 通路（宿主免疫反应的关键组成部分）至关重要对入侵的病原体。 IKBKG 的致病变异与三种临床表型相关：外胚层发育不良和免疫缺陷 1 [MIM:300291]、免疫缺陷 33 [MIM:300636] 和色素失禁 [MIM:308300]，并取决于序列改变，广泛的表型谱是可能的。亚型半合子 IKBKG 致病变异通常与伴有或不伴有无汗性外胚层发育不良的免疫缺陷相关。从广义上讲，改变 C 末端锌指结构域的致病变异，就像我们先证者的变异一样，具有更严重的临床过程。以前，一个具有几乎相同 IKBKG 变体 (c.1259A > G) 的男婴被描述为具有表型重叠我们的病人。他患有免疫缺陷，表现为反复感染和骨硬化症，并在 2.5 岁时死于肺结核24。据报道，另一名男性具有相同的变异，通过长程 PCR 和 Sanger 测序鉴定，临床表现以骨质疏松症和革兰氏阴性和阳性细菌、真菌和分枝杆菌的反复感染为特征，他最终在这个年龄死亡1.5 年 25。

强制调用 NGS 死区以恢复具有低比对分数

的变体 对 F12 中 p.X420Yext27 变体的目视检查显示，该变体也作为明显的杂合突变存在于短读长测序中，但是，因为与变体重叠的读长不能明确地与 IKBKG 或其假基因对齐，则读数被认为质量差，并且没有通过标准管道调用变体。这与可以明确地与该区域对齐的长读长测序相反，因此标准变体调用者可以识别没有修改的变体。

为了尝试恢复具有低映射分数的变体，例如在这种情况下，我们强制在 1226 个样本的 NGS 死区中调用变体。这是通过允许所有映射读取（尽管它们的质量）用于变体调用来实现的。我们在每个基因组的死区中平均鉴定了 120.9 个编码变体。我们在 IKBKG 中发现了另外两个变体：第一个是 p.X420Yext27，在一名男婴 (K1) 中出现嗜睡、肌张力减退、羊水过少、低血糖、进行性脑病和呼吸衰竭，与 F12 中看到的变体相同，并且是显然是母系遗传。第二个是另一个男婴 (K2) 中的新变体 (p.H413Y; VCV00068233)，没有可用的父母 NGS 数据。对 K1 中 p.X420Yext27 的正交询问未能确认该变异发生在 IKBKG 的编码序列中，因此被认为是假阳性。第二个变体在 K2 和他的母亲身上都得到了验证。尽管根据 ACMG 标准，它最终被归类为具有不确定意义 (VUS) 的变体，但存在可信的表型重叠。先证者是一名两周大的足月男性，在院外心脏骤停后住进儿科重症监护室 (PICU)。他的血培养长出了多个革兰氏阴性杆菌（阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌），他的脑脊液中也长出了阴沟肠杆菌。咨询了临床遗传学团队，并担心潜在的免疫缺陷。鉴于以前健康的足月婴儿的大量感染，医学遗传学家建议进行全基因组测序，以评估先天性免疫错误。尽管进行了 3 次血管活性输注的最大医疗护理，但患者在入院后不到 3 天死于难治性感染性休克。